Развитие методов геномного редактирования для генной терапии мышечной дистрофии Дюшенна

Цель. Провести систематический анализ современных научных данных, посвященных применению технологии геномного редактирования CRISPR-Cas9 для коррекции мутаций в гене DMD, рассматривая путь от фундаментальных доклинических исследований до первых клинических попыток.

Основные положения. Патогенез мышечной дистрофии Дюшенна обусловлен дефицитом дистрофина, приводящим к нестабильности сарколеммы, хроническому повреждению миофибрилл и их прогрессирующей потере с замещением фиброзной и жировой тканью. Стратегии CRISPR-Cas9, направленные на восстановление рамки считывания или доставку функционального гена, демонстрируют потенциал для патогенетического лечения. Ключевыми задачами, определяющими перевод технологии в клинику, являются разработка эффективных и безопасных систем доставки редакторов в мышечную ткань, минимизация off-target-эффектов и преодоление иммунных реакций.

Заключение. Проанализированные исследования подтверждают принципиальную возможность использования CRISPR-Cas9 для коррекции генетического дефекта при мышечной дистрофии Дюшенна в экспериментальных моделях. Дальнейшее развитие направления связано с оптимизацией безопасности, эффективности доставки и освоением более точных технологий, таких как редактирование оснований и прайм-редактирование, что открывает путь к созданию персонализированных терапевтических стратегий.

Ключевые слова: CRISPR-Cas9, генная терапия, геномное редактирование, дистрофин, доставка in vivo, мышечная дистрофия Дюшенна, экзон-скиппинг

Скачать PDF

Роман А.Д., Егорова А.А., Коган И.Ю., Киселев А.В. Развитие методов геномного редактирования для генной терапии мышечной дистрофии Дюшенна. Женское здоровье и репродукция. 2026. № 1 (70). DOI: 10.31550/2712-8598-2026-1-10-ZhZiR. URL:  https://journalgynecology.ru/statyi/razvitie-metodov-genomnogo-redaktirovaniya-dlya-gennoj-terapii-myshechnoj-distrofii-djushenna/(дата обращения: дд.мм.гггг)

A.D. Roman, A.A. Egorova, I.Yu. Kogan, A.V. Kiselev

Research Institute of Obstetrics, Gynecology and Reproductology named after D.O. Ott; Saint Petersburg, Russian Federation

 

Abstract

Aim. To conduct a systematic analysis of current scientific data on the application of the CRISPR-Cas9 genome editing technology for correcting mutations in the DMD gene, tracing the path from fundamental preclinical research to initial clinical attempts.

Key points. The pathogenesis of Duchenne muscular dystrophy is caused by dystrophin deficiency, which leads to sarcolemma instability, chronic damage to myofibrils, and their progressive loss with replacement by fibrous and adipose tissue. CRISPR-Cas9 strategies aimed at restoring the reading frame or delivering a functional gene demonstrate potential for pathogenetic treatment. The key challenges determining the translation of this technology into the clinic are the development of effective and safe delivery systems for the editing tools into muscle tissue, minimizing off-target effects, and overcoming immune responses.

Conclusion. The analyzed studies confirm the fundamental possibility of using CRISPR-Cas9 to correct the genetic defect in Duchenne muscular dystrophy in experimental models. The further development of this field is associated with the optimization of safety, delivery efficiency, and the adoption of more precise technologies such as base editing and prime editing, which paves the way for creating personalized therapeutic strategies.

Keywords: Duchenne muscular dystrophy, dystrophin, CRISPR-Cas9, genome editing, gene therapy, exon skipping, in vivo delivery.

А.Д. Роман, А.А. Егорова, И.Ю. Коган, А.В. Киселев

ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии имени Д.О. Отта»; Россия, г. Санкт-Петербург

 

Мышечная дистрофия Дюшенна

Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) является наиболее распространенной и тяжелой формой наследственных мышечных дистрофий в детском возрасте. Заболевание наследуется по Х-сцепленному рецессивному типу и характеризуется прогрессирующей мышечной слабостью, потерей способности к самостоятельному передвижению, развитием кардиомиопатии, дыхательной недостаточности и преждевременной смертью. Как правило, пациенты живут около 20 лет, после чего умирают от кардиологических осложнений и проблем с дыхательной мускулатурой [1]. Причиной МДД служат мутации в гене DMD, которые нарушают синтез белка дистрофина — центрального компонента дистрофин-ассоциированного гликопротеинового комплекса. Это приводит к дестабилизации связи цитоскелета с внеклеточным матриксом, делая сарколемму мышечных волокон уязвимой к повреждениям при сокращении [2].

Мышечная дистрофия Беккера (МДБ) — аллельная форма МДД, возникающая вследствие мутаций в гене DMD, кодирующем белок дистрофин. Ключевое отличие от МДД заключается в типе мутации: при МДБ происходят делеции или дупликации, которые не сдвигают рамку считывания генетического кода. Это позволяет мышечным клеткам синтезировать укороченную, но частично функциональную версию дистрофина. Наличие такого дефектного белка стабилизирует мышечные мембраны в достаточной степени, чтобы отсрочить начало и замедлить прогрессирование заболевания, однако он не обеспечивает полной защиты от развития симптомов заболевания [3]. Кроме того, известно, что некоторые «внутрирамочные» делеции все же вызывают МДД, если они слишком велики или затрагивают критические домены белка (например, цистеиновый). И наоборот, некоторые сдвигающие рамку мутации могут приводить к МДБ благодаря механизмам альтернативного сплайсинга, которые восстанавливают рамку считывания на уровне матричной РНК [4].

 

Ген DMD и белок дистрофин 

Ген DMD, ответственный за развитие МДД и МДБ, является крупнейшим известным геном. Его размер составляет около 2,2 млн пар оснований, он состоит из 79 экзонов, а также восьми независимых тканеспецифичных промоторов, что обусловливает сложность его организации и регуляции [5].

Мутации в гене DMD отличаются высоким разнообразием и включают крупные перестройки (делеции и дупликации), на которые приходится бо́льшая часть случаев, а также точечные мутации (нонсенс, миссенс, мелкие инсерции и делеции и сплайсинг-мутации) — они встречаются реже [6]. При этом существуют «горячие точки» возникновения мутаций — области, где делеции и дупликации происходят наиболее часто. Основной кластер делеций приходится на экзоны 45–55, что охватывает около 70% всех случаев делеций. Это имеет важное значение для разработки терапии, так как пропуск некоторых экзонов из данной области (например, экзона 51) может быть применим к большому числу пациентов [7]. В отличие от делеций, которые имеют два выраженных кластера («горячих точки»), дупликации в гене дистрофина встречаются реже и преимущественно сосредоточены в одном основном проксимальном кластере (экзонах 8–15), причем чаще всего затрагиваются экзоны 11–13 [8].

Белок дистрофин играет критическую роль в поддержании целостности сарколеммы мышечных волокон, будучи связующим звеном между внутриклеточным актиновым цитоскелетом и внеклеточным матриксом через дистрогликановый комплекс [9]. Помимо выполнения структурной роли, дистрофин выступает в качестве ключевого организатора сигнальных процессов в мышечных клетках. Его отсутствие приводит к нарушению регуляции нескольких критических путей: делокализации нейрональной синтазы оксида азота и, как следствие, нарушению вазодилатации и развитию функциональной ишемии, нарушению гомеостаза кальция, вызывающему активацию кальпаинов и гибель клеток, а также к усиленному образованию активных форм кислорода вследствие дезорганизации микротрубочек и гиперактивности NADPH-оксидазы 2 [10].

 

Ограничения существующих терапий

Современные подходы к терапии, включая применение кортикостероидов (например, преднизолона и дефлазакорта) для снижения воспаления и сохранения мышечной функции, а также препаратов, действие которых направлено на устранение последствий мутаций (например, аталурена, который помогает рибосоме игнорировать преждевременный стоп-кодон у пациентов с нонсенс-мутациями), позволяют замедлить прогрессирование заболевания, продлить способность к самостоятельной ходьбе и сохранить дыхательную функцию, не устраняя при этом генетическую первопричину болезни [11]. Патогенетические стратегии, в том числе пропуск экзонов с помощью антисмысловых олигонуклеотидов (этеплирсена, голодирсена и др.) и заместительная генная терапия с использованием микродистрофина (деладистрогена моксепарвовека), демонстрируют обнадеживающие результаты, однако их эффективность ограничена необходимостью пожизненного введения или достижением лишь умеренного уровня белка [12].

В этом контексте технология геномного редактирования CRISPR-Cas9 открыла новую эру, предложив потенциально долговременное решение — прямое исправление мутации в геноме пациента.

 

Система CRISPR-Cas9 как инструмент для редактирования генома

Система CRISPR-Cas изначально была идентифицирована у бактерий и архей как защитный механизм, обеспечивающий адаптивный иммунитет против чужеродных генетических элементов, таких как вирусы и плазмиды. Этот процесс включает три ключевые стадии: приобретение фрагментов ДНК вируса (спейсеров) и их интеграцию в CRISPR-локус хозяина, экспрессию и созревание CRISPR-РНК, и, наконец, интерференцию — уничтожение целевой ДНК с помощью Cas-белков [13]. Фундаментальное понимание работы системы типа II, в которой ключевым эффектором является белок Cas9, стало поворотным моментом, позволившим превратить этот бактериальный иммунный механизм в мощнейший инструмент для редактирования генов [14].

Принцип работы природной системы Cas9 основан на слаженном взаимодействии нескольких компонентов (рис. 1). После интеграции нового спейсера вся CRISPR-область транскрибируется в длинную предшественницу пре-CRISPR-РНК. Однако для активации системы эта молекула должна быть нарезана на короткие зрелые CRISPR-РНК, каждая из которых содержит последовательность одного спейсера. Ключевую роль в этом процессе созревания играет небольшая некодирующая РНК, называемая транс-активирующей РНК. Ее последовательность комплементарна повторам в пре-CRISPR-РНК, что позволяет им спариваться с образованием двухцепочечной РНК-структуры. Этот дуплекс затем распознается и разрезается клеточным ферментом РНКазой III в присутствии белка Cas9, что в итоге приводит к образованию зрелых CRISPR-РНК [15]. На этапе интерференции зрелая CRISPR-РНК и транс-активирующая РНК остаются связанными с белком Cas9, формируя рибонуклеопротеиновый комплекс, который осуществляет поиск чужеродной ДНК. Важнейшим условием для узнавания является наличие короткой специфической последовательности, называемой PAM (protospacer adjacent motif), которая расположена непосредственно рядом с целевым участком (протоспейсером). После распознавания специфической последовательности ДНК, комплементарной участку CRISPR-РНК, и при наличии непосредственно следующего за ней короткого PAM-мотива (например, NGG) белок Cas9 разрезает обе цепи мишени. Это осуществляется двумя разными нуклеазными доменами: домен HNH расщепляет цепь, комплементарную CRISPR-РНК, а домен RuvC — противоположную цепь. Созданный двухцепочечный разрыв ДНК инактивирует чужеродный генетический элемент [16].

 

Рис. 1. Схема механизма геномного редактирования с помощью CRISPR/Cas: A — механизм действия CRISPR/Cas, B — пример генетической конструкции, экспрессирующей элементы CRISPR/Cas (адаптировано из [17])

Превращение этой системы в революционный медицинский и биотехнологический инструмент произошло благодаря осознанию того, что ее возможно перепрограммировать. Исследователи обнаружили, что, создав искусственную направляющую РНК с нужной последовательностью спейсера, можно заставить комплекс Cas9 направленно разрезать любой заданный участок ДНК в любом геноме. Еще более важным шагом стало создание химерной одноцепочечной направляющей РНК, которая представляет собой слияние функциональных частей CRISPR-РНК и транс-активирующей РНК [18]. Данная конструкция радикально упростила применение системы, так как для нацеливания на новый ген требовалось создать лишь короткую РНК, комплементарную мишени. Таким образом, комплекс, состоящий из универсального фермента Cas9 и программируемой одноцепочечной направляющей РНК, стал способен вносить разрывы в заданные последовательности сложных геномов.

 

Стратегии CRISPR-Cas9 для коррекции мутаций при мышечной дистрофии Дюшенна

Стратегии использования CRISPR-Cas9, применяемые для лечения МДД, направлены на восстановление открытой рамки считывания гена DMD, что позволяет производить функциональный, хотя часто и укороченный, белок дистрофина. Такой подход имитирует естественное течение болезни Беккера, при которой синтезируется частично функциональный дистрофин, что приводит к более легкому течению заболевания. Основные методы редактирования включают удаление или модификацию определенных экзонов, что позволяет восстановить рамку считывания транскрипта и, как следствие, экспрессию белка [19].

 

Подходы, требующие двуцепочечных разрывов ДНК

1. Удаление экзонов

Данная стратегия предполагает использование двух одноцепочечных гидовых РНК, которые направляют Cas9 для создания двуцепочечных разрывов в интронных регионах, фланкирующих целевой(ые) экзон(ы) (рис. 2A). Это приводит к удалению одного или нескольких экзонов в процессе репарации негомологичного соединения концов. Так, для коррекции делеции экзона 45 в фибробластах пациента был применен метод CRISPR-Cas9 с двумя направляющими РНК, нацеленными на экзон 44. Это позволило создать внутриэкзонную делецию, что восстановило правильную рамку считывания гена DMD. Чтобы проверить функциональность исправленного гена, отредактированные фибробласты были преобразованы в мышечные трубки. Этот процесс был инициирован с помощью лентивирусного вектора: с его помощью доставлен ген MyoD, ключевой регулятор мышечной дифференцировки. В результате в полученных мышечных трубках была подтверждена успешная экспрессия гена дистрофина как на уровне матричной РНК, так и на уровне белка. Эффективность редактирования составила около 50%, а в более чем 60% случаев разрезание и соединение ДНК произошло без ошибок, что и обеспечило успех коррекции [20]. Этот подход особенно эффективен для коррекции крупных делеций, затрагивающих «горячие точки» мутаций в гене DMD.

 

Рис. 2. Подходы к использованию CRISPR/Cas для коррекции мутаций при мышечной дистрофии Дюшенна: A — удаление экзона, В — пропуск экзона с помощью модификации сайтов сплайсинга, C — восстановление рамки считывания, D — создание гибридных экзонов. Пояснение в тексте статьи (адаптировано из [19])

 

2. Пропуск экзона с помощью модификации сайтов сплайсинга

В случае данного подхода одиночная направляющая РНК нацеливает комплекс CRISPR-Cas9 на ключевые последовательности в донорных или акцепторных сайтах сплайсинга целевого экзона (рис. 2B). Создание двуцепочечного разрыва и последующее восстановление ДНК через механизм негомологичного соединения концов приводит к возникновению небольших делеций или вставок (инделов). Эти мутации нарушают канонические последовательности сайтов сплайсинга (GT/AG), что в результате заставляет сплайсеосому «пропускать» этот экзон при сборке зрелой мРНК, восстанавливая таким образом открытую рамку считывания белка.

В исследовании Y.L. Min и соавт. (2019) данный метод был успешно применен для коррекции одной из наиболее частых мутаций, вызывающих МДД, — делеции экзона 44. Ученые использовали одноцепочечную гидовую РНК для нацеливания на акцепторный сайт сплайсинга экзона 45 в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (иПСК), полученных от пациента с делецией экзона 44. После редактирования и дифференцировки иПСК в кардиомиоциты было зафиксировано восстановление синтеза полноразмерного белка дистрофина. Эффективность редактирования подтверждена вестерн-блоттингом и иммунофлуоресцентным окрашиванием белка в клетках. Аналогичный подход, но направленный на донорный сайт экзона 43, также привел к успешному пропуску экзона и восстановлению рамки считывания [21].

Таким образом, данный метод геномного редактирования функционально имитирует действие одобренных терапевтических антисмысловых олигонуклеотидов (например, этеплирсена), но с ключевым преимуществом: поскольку изменение вносится непосредственно в геном, однократная процедура теоретически может обеспечить долговременную продукцию дистрофина в постмитотических кардиомиоцитах и в ядрах существующих мышечных волокон. Однако долгосрочная стабильность эффекта в скелетных мышцах, чьи клетки-предшественники постепенно обновляют мышечные волокна, требует дальнейших исследований.

3. Восстановление рамки считывания с помощью инделов

Этот подход — альтернатива методам доставки полноразмерной копии гена или удаления нескольких экзонов. Стратегия основана на таргетном создании двуцепочечного разрыва в области мутации с использованием системы CRISPR-Cas. Репарация данного разрыва по пути негомологичного соединения концов индуцирует образование случайных инделов. Критическим условием эффективности является возникновение инделов, размер которых кратен трем нуклеотидам, что приводит к восстановлению открытой рамки считывания и возможности синтеза функционального белка (рис. 2C).

Для реализации данного подхода была применена компактная нуклеаза CjCas9, выделенная из Campylobacter jejuni. Малый размер ее кодирующей последовательности позволил осуществить упаковку в единый вектор на основе аденоассоциированного вируса серотипа 9 (ААВ9), включающего ген нуклеазы, направляющую РНК и ген репортерного белка GFP. Внутримышечное введение этой конструкции типа «all-in-one» в переднюю большеберцовую мышцу мышам двух линий с разными нокаутными мутациями в гене Dmd (1-нуклеотидной вставкой и 14-нуклеотидной делецией) привело к высокой терапевтической эффективности даже при относительно низкой общей частоте редактирования.

Терапевтический эффект был верифицирован на молекулярном, гистологическом и функциональном уровнях. Иммунофлуоресцентный анализ подтвердил возобновлении экспрессии гена дистрофина с корректной сарколемной локализацией его продукта в 28–39% мышечных волокон. Восстановленный дистрофин проявлял функциональную активность, что подтверждалось привлечением нейрональной синтазы оксида азота в дистрофин-ассоциированный белковый комплекс. Наиболее значимо, что у животных было зафиксировано достоверное улучшение мышечной функции: удельная сила изолированной мышцы достигала значений, характерных для дикого типа. При этом метод продемонстрировал высокий профиль специфичности: не выявлено детектируемых нецелевых мутаций [22].

4. Создание гибридных экзонов

Ключевое преимущество стратегии создания гибридных экзонов заключается в ее двойном терапевтическом эффекте. Во-первых, как и другие методы редактирования генома при МДД, данный метод восстанавливает открытую рамку считывания гена DMD. Это необходимое условие для того, чтобы мышечные клетки смогли начать синтез белка дистрофина, отсутствующего у пациентов. Однако, в отличие от простого удаления экзона, метод гибридных экзонов позволяет решить вторую, не менее важную задачу: сохранение правильной пространственной структуры белка.

Центральная часть дистрофина состоит из 24 повторяющихся структурных блоков — спектрин-подобных повторов (spectrin-like repeats — SLR). Каждый SLR представляет собой прочную трехспиральную структуру, стабильность которой обеспечивается точным чередованием аминокислот с определенными свойствами.

При стандартном удалении экзона точка соединения оставшихся частей гена часто нарушает чередование функциональных элементов. В результате восстановленный дистрофин может иметь дефект в своей структуре — «слабое звено» в цепи, что снижает его стабильность и функциональность.

Метод гибридных экзонов решает эту проблему. Путем точного подбора целевых последовательностей для системы CRISPR/SaCas9 разрывы создаются в таких местах внутри экзонов 47 и 58, что после их сшивания образуется новый, гибридный экзон (рис. 2D). Выбор данных экзонов обоснован тем, что большинство мутаций попадает в промежуток между ними, при этом экзоны 44–46 остаются нетронутыми, поскольку кодируют часть белка, которая необходима для связывания с важным ферментом — нейрональной синтазой оксида азота. Полученный в результате гибридный экзон кодирует укороченный, но структурно целостный спектрин-подобный повтор. В данном новом повторе критически важные аминокислоты занимают правильное положение, сохраняя трехспиральную архитектуру, аналогичную нативной.

В исследовании на мышиной модели del52hDMD/mdx (с делецией экзона 52 в человеческом гене DMD) системная доставка гена SaCas9 и пары sgRNA (3–47/16–58 или 5–47/18–58) в составе вектора ААВ9 привела к образованию гибридного экзона 47–58. Это, в свою очередь, восстановило синтез усеченного, но функционального дистрофина. Важно отметить, что восстановление синтеза дистрофина in vivo было достоверно показано в первую очередь в кардиомиоцитах; в скелетных мышцах (диафрагме и передней большеберцовой мышце) гибридные экзоны в данном эксперименте детектировались плохо, предположительно, из-за низкой эффективности трансдукции. Секвенирование подтвердило, что от 83 до 86% образовавшихся гибридных экзонов имели правильную, ожидаемую последовательность, что обеспечивало синтез полнофункционального белка [23].

 

Подходы, не требующие двуцепочечных разрывов

Для преодоления потенциальных рисков, связанных с образованием двуцепочечных разрывов ДНК, таких как крупные делеции и нежелательные хромосомные перестройки, разработаны более точные технологии редактирования генома. Эти методы позволяют вносить целевые изменения без индукции двуцепочечных разрывов, что повышает их безопасность и снижает вероятность нецелевого редактирования.

1. Редактирование оснований

Редактирование оснований — это метод геномного редактирования, использующий каталитически ослабленную форму белка Cas9 (Cas9-никазу), способную расщеплять только одну цепь ДНК. Данный фермент слит с ферментом деаминазой, которая осуществляет прямое химическое преобразование одного нуклеотида в другой, что позволяет вносить точечные мутации без создания двунитевых разрывов ДНК и связанных с этим рисков.

Использование данного подхода на моделях МДД продемонстрировало его высокую эффективность. В исследовании на взрослых мышах линии mdx4cv, несущих нонсенс-мутацию в экзоне 53 гена DMD, был использован оптимизированный редактор оснований iABE-NGA, способный распознавать ослабленную PAM-последовательность (NG) [24]. Понятие ослабленной PAM-последовательности относится к инженерным вариантам нуклеазы Cas9, у которых требования к консенсусному мотиву, прилегающему к целевому сайту, ослаблены по сравнению с диким типом белка. В случае варианта SpCas9-NG это позволяет системе нацеливаться на сайты с PAM-последовательностями формата NG, что значительно расширяет спектр потенциальных мишеней в геноме по сравнению с канонической системой SpCas9, требующей строгого NGG-мотива [25]. Для преодоления ограничения на размер упаковки аденоассоциированного вируса (ААВ) редактор был доставлен с помощью двух раздельных векторов ААВ9, которые собирались в полноразмерный белок.

Однократная системная доставка редактора оснований iABE-NGA привела к восстановлению экспрессии дистрофина примерно в 42% кардиомиоцитов через 5 недель после инъекции. Важно отметить, что эффект был долговременным: через 10 месяцев после лечения уровень дистрофина в сердце достиг почти 96% от нормы. Терапия также привела к значительному улучшению внешнего строения мышц и их сократительной функции, при этом нецелевая активность редактора оставалась низкой, а токсичность — минимальной [24].

В исследовании F. Chemello и соавт. (2021) редактирование донорного сайта сплайсинга экзона 50 с помощью аденинового базового редактора ABEmax позволило индуцировать его пропуск. Эта стратегия восстановила рамку считывания и экспрессию дистрофина как в кардиомиоцитах человека, полученных из иПСК с делецией экзона 51, так и в скелетных мышцах мышиной линии ΔEx51 после доставки системы in vivo с помощью ААВ9 [26].

2. Прайм-редактирование

Прайм-редактирование (prime editing) включает несколько последовательных стадий. Ключевым компонентом системы является химерный белок — прайм-редактор, полученный путем слияния каталитически ослабленной Cas9-никазы и обратной транскриптазы вируса лейкоза. Мутация H840A в домене HNH белка Cas9 инактивирует расщепление цепи, комплементарной гидовой РНК, в результате чего белок делает одноцепочечный разрыв только в PAM-содержащей цепи ДНК. Образовавшийся в результате разрыва 3′-гидроксильный конец служит праймером, который гибридизуется с PBS-участком прайм-редактирующей гидовой РНК. В результате инициируется синтез новой цепи ДНК обратной транскриптазой. Вновь синтезированный фрагмент ДНК, несущий целевое изменение, вытесняет исходный комплементарный участок на репарируемой цепи. Клеточные системы репарации, в частности эндонуклеазы, предпочтительно удаляют вытесненный исходный участок, что способствует лигированию новосинтезированного сегмента с разрывом в цепи ДНК. В результате формируется гетеродуплекс, в котором одна цепь содержит редактирование, а комплементарная ей цепь остается неизменной. Далее в результате репарации неспаренных оснований клетка распознает отредактированную цепь как правильную и использует ее как шаблон для исправления исходной цепи. Это приводит к тому, что изменение закрепляется в обеих цепях ДНК и становится постоянным. 

Для повышения эффективности редактирования разработаны системы PE3 и PE3b. В системе PE3 используется дополнительная одноцепочечная направляющая РНК, направляющая ту же самую Cas9-никазу в составе прайм-редактора на внесение разреза в неотредактированную цепь ДНК. Этот второй разрез стимулирует репарацию данной цепи с использованием отредактированной цепи в качестве матрицы, что значительно увеличивает долю клеток с гомозиготным редактированием. С помощью системы PE3b осуществляется дальнейшая оптимизация: дополнительная одноцепочечная направляющая РНК спроектирована так, чтобы эффективно связываться и вносить разрыв только после того, как целевая цепь была отредактирована, что минимизирует образование двойных разрывов и снижает частоту инделов [27].

Исследования по применению прайм-редактирования для терапии МДД продемонстрировали, что данная технология является эффективным инструментом для коррекции широкого спектра мутаций. В работе F. Chemello и соавт. на модели кардиомиоцитов человека с делецией экзона 51 с помощью прайм-редактирования была точно вставлена последовательность из двух нуклеотидов в экзон 52, что восстановило правильную рамку считывания гена дистрофина. Эффективность редактирования достигла 54%, что привело к возобновлению синтеза дистрофина и нормализации сократительной функции клеток [26]. Исследование C. Happi Mbakam и соавт. продемонстрировало, что прайм-редактирование позволяет вносить специфические точечные мутации в различные экзоны гена DMD, такие как экзоны 9, 20, 35, 43, 55 и 61, с эффективностью до 16% после нескольких циклов трансфекции клеточной линии HEK293T [28].

 

Модели для доклинических исследований вариантов терапии мышечной дистрофии Дюшенна

Доклинические исследования различных вариантов терапии для МДД проводятся на ряде моделей. Они варьируются от простых систем in vitro до сложных in vivo, каждая из которых обладает уникальными преимуществами для моделирования заболевания и тестирования терапевтических препаратов.

Клеточные модели in vitro

Ключевыми инструментами для изучения молекулярных механизмов МДД являются модели in vitro. Наиболее релевантные из них — иммортализованные мышечные клетки пациентов и иПСК. иПСК, репрограммированные из соматических клеток пациентов (например, фибробластов кожи), могут быть дифференцированы в кардиомиоциты и миотрубки, несущие конкретную мутацию пациента. Данные пациент-специфичные клетки позволяют изучать патогенез заболевания и тестировать такие перспективные подходы, как редактирование генома, непосредственно в человеческом клеточном контексте. Это особенно важно для оценки восстановления синтеза дистрофина и функциональных улучшений в кардиомиоцитах, которые сложно изучать в животных моделях [29].

Животные модели in vivo

Заболевание, аналогичное МДД, идентифицировано у нескольких видов млекопитающих, однако его фенотипические проявления значительно варьируются [30], что обуславливает необходимость использования разных животных моделей на различных этапах разработки терапии.

Мышиные модели. Мышиная модель МДД первоначально обнаружена в колонии мышей C57BL/10ScSn [31], а ее аналогия с МДД человека подтверждена идентификацией нонсенс-мутации в экзоне 23 гена дистрофина у мышей линии mdx [32]. Хотя в раннем возрасте патологическое состояние мышей mdx соответствует таковому у пациентов, заболевание прогрессирует гораздо медленнее, а продолжительность жизни снижается лишь на 25% [33, 34].

Созданы и другие линии мышей с мутациями в разных частях гена DMD, такие как mdx4cv (мутация в экзоне 53) [35], а также линии, полученные методами генной инженерии, включая мышей mdx52 с делецией 52 экзона, которые считаются более близкими к человеку по тяжести течения заболевания [36]. Для исследований клеточной и генной терапии получены иммунодефицитные линии мышей mdx, позволяющие оценивать эффективность подходов в отсутствие иммунного ответа [37, 38]. Для тестирования терапевтических средств, нацеленных непосредственно на человеческую последовательность гена, созданы «гуманизированные» модели, несущие человеческий трансген DMD [39].

Крупные животные модели. Мышиные модели не подходят для решения задач масштабирования производства терапевтических агентов и оценки системной доставки в крупные организмы. В этом контексте незаменимыми становятся модели на крупных животных.

Собачья модель GRMD. Прогрессирующая мышечная дистрофия у золотистых ретриверов (GRMD) с Х-сцепленным наследованием впервые описана в 1958 г., а в дальнейшем установлено отсутствие белка дистрофина у этих собак [40]. Причиной является мутация в сайте сплайсинга интрона 6, приводящая к исключению экзона 7 и нарушению рамки считывания [41]. Течение заболевания у GRMD-собак практически идентично симптомам МДД у людей, включая тяжелый прогрессирующий фенотип с мышечной слабостью, фиброзом и кардиореспираторными нарушениями [42]. Эта модель считается золотым стандартом для финальных этапов доклинических испытаний, она позволяет оценить системную доставку терапии, ее долгосрочную безопасность и функциональную эффективность.

Свиные модели. Свиньи представляют собой новую перспективную крупную модель МДД. Созданы свиньи с делецией 52 экзона гена DMD, которые проявляют ключевые признаки патологии человека: потерю дистрофина, прогрессирующую мышечную дистрофию и нарушение подвижности [43]. Размер тела и физиология мышц свиней более схожи с человеческими, чем у грызунов, что делает их идеальной моделью для оптимизации методов доставки терапии во все группы мышц, включая сердце и диафрагму, и для оценки функциональных исходов [44]. Другая модель была получена с помощью системы CRISPR-Cas9, нацеленной на экзон 27 [45]. Хотя данные модели крайне перспективны для отработки генной терапии, их практическая ценность может быть повышена за счет улучшения жизнеспособности животных.

 

Ключевые проблемы и пути их решения

Доставка геном-редактирующих генетических конструкций в мышцы и сердце

Основным инструментом для доставки компонентов CRISPR in vivo остаются ААВ благодаря их высокой эффективности трансдукции мышечной ткани. Однако малая вместимость ААВ, составляющая приблизительно ~5.0 тысяч пар нуклеотидов для интактного генома [46], является серьезным ограничением для доставки крупных генов, таких как ген, кодирующий нуклеазу SpCas9. Для преодоления этого ограничения были разработаны различные стратегии, включающие использование компактных нуклеаз (SaCas9, CjCas9), разделение системы на два вектора и применение интеин-опосредованного транс-сплайсинга, когда белок Cas9 собирается из двух фрагментов внутри клетки.

Невирусные системы доставки, такие как липидные наночастицы и нуклеопептидные комплексы на основе липо-ксенопептидов, активно разрабатываются для доставки CRISPR-Cas9 в форме мРНК и одноцепочечной гидовой РНК. Эти синтетические носители позволяют преодолеть ограничения, связанные с вирусными векторами, в том числе ограниченную грузоподъемность и риски иммуногенности и интеграции в геном [47].

 

Безопасность геномного редактирования

Нецелевое редактирование (off-target editing) остается одной из главных проблем безопасности терапевтического применения систем CRISPR-Cas. Одним из наиболее эффективных подходов к ее решению является использование высокоточных вариантов Cas9, разработанных для минимизации неспецифических взаимодействий с ДНК. Ярким примером служит эндонуклеаза SpCas9-HF1 (high-fidelity 1), содержащая четыре точечные аланиновые замены (N497A, R661A, Q695A, Q926A) в доменах, взаимодействующих с сахарофосфатным остовом ДНК. B.P. Kleinstiver и соавт. продемонстрировали, что SpCas9-HF1 обладает эффективностью редактирования на целевом сайте после направленной доставки в клетки, сопоставимой с диким типом SpCas9, но при этом для большинства одноцепочечных направляющих РНК не приводит к появлению нецелевых эффектов, которые можно было бы обнаружить на уровне всего генома. Для дальнейшего повышения безопасности также рекомендуется использовать доставку в виде прекомпонованных рибонуклеопротеиновых комплексов, что сокращает время экспозиции нуклеазы в клетке, и проводить тщательный биоинформатический дизайн одноцепочечных направляющих РНК с последующей экспериментальной проверкой их специфичности [48].

Иммунный ответ при CRISPR/Cas9-терапии может быть направлен как против бактериального белка Cas9, так и против капсида вирусного вектора (например, ААВ). Предсуществующий гуморальный и клеточный иммунитет к распространенным серотипам ААВ и к Cas9, выявленный у значительной части населения, может ограничить эффективность терапии и вызвать воспалительные реакции, включая уничтожение отредактированных клеток цитотоксическими T-лимфоцитами. Для минимизации этих рисков предлагаются различные стратегии: скрининг пациентов на наличие антител и T-клеток к Cas9 и ААВ, использование иммуносупрессии, применение тканеспецифичных промоторов, поиск менее иммуногенных вариантов Cas9 из редких бактерий, а также использование невирусных методов доставки (например, липонуклеопротеинов для мРНК или рибонуклеопротеиновых комплексов), которые позволяют избежать иммунного ответа на вирусный капсид и обеспечивают кратковременную экспрессию Cas9, снижая риск долгосрочной иммунной активации [49].

 

Долгосрочная эффективность терапии с помощью CRISPR-Cas

Для обеспечения долговременной экспрессии укороченного гена дистрофина, полученного в результате геномного редактирования, необходимо отредактировать не только зрелые мышечные волокна, но и пул мышечных стволовых клеток (сателлитных клеток). Данные клетки ответственны за регенерацию мышц после повреждений. Если они останутся неотредактированными, то вновь образованные мышечные волокна, возникающие в течение жизни пациента, снова будут лишены дистрофина, что приведет к постепенной потере терапевтического эффекта. Доказано, что редактирование сателлитных клеток с помощью ААВ-CRISPR возможно, и это способствует поддержанию экспрессии дистрофина в течение длительного времени у модельных мышей [50].

 

Заключение

Геномное редактирование предлагает принципиально новый подход к лечению МДД. Эта технология обладает потенциалом стать одноразовым вмешательством, которое может быть применено к широкой группе пациентов. Стратегии, нацеленные на «горячие точки» мутаций (например, удаление экзонов 45–55), в отличие от персонализированных подходов, потенциально подходят для большинства пациентов с МДД, что приближает создание универсального лечения.

Несмотря на впечатляющие успехи, перед переходом данной технологии в клинику необходимо преодолеть ключевые вызовы. Главным из них остается обеспечение долгосрочной безопасности, включая минимизацию нецелевого редактирования и иммунных реакций, а также наличия эффективных и безопасных систем доставки, способных достичь всех скелетных мышц и сердца в организме человека.

Однако взгляд в будущее оптимистичен. Активный прогресс в решении данных проблем и успешное проведение клинических испытаний CRISPR-терапий для других заболеваний обнадеживают. Учитывая текущие темпы развития, можно с уверенностью ожидать, что первые клинические испытания CRISPR-терапии для МДД состоятся в обозримом будущем, и у тысяч пациентов и их семей появится надежда на преобразующее лечение.

 

Дополнительная информация

Исследование выполнено в рамках темы ФНИ № 1024032800230-9-3.2.2

1. Emery A.E.H., Muntoni F., Quinlivan R. Duchenne muscular dystrophy. 4th ed. Oxford, UK: Oxford University Press; 2015.
2. Gao Q.Q., McNally E.M. The dystrophin complex: structure, function, and implications for therapy. Compr. Physiol. 2015;5(3):1223–39. DOI: 10.1002/cphy.c140048
3. Straub V., Guglieri M. An update on Becker muscular dystrophy. Curr. Opin. Neurol. 2023;36(5):450–4. DOI: 10.1097/WCO.0000000000001191
4. Aartsma-Rus A., Van Deutekom J.C., Fokkema I.F., Van Ommen G.J. et al. Entries in the leiden Duchenne muscular dystrophy mutation database: an overview of mutation types and paradoxical cases that confirm the reading-frame rule. Muscle Nerve. 2006;34(2):135–44. DOI: 10.1002/mus.20586
5. Nallamilli B.R.R., Chaubey A., Valencia C.A., Stansberry L. et al. A single NGS-based assay covering the entire genomic sequence of the DMD gene facilitates diagnostic and newborn screening confirmatory testing. Hum. Mutat. 2021;42(5):626–38. DOI: 10.1002/humu. 24191
6. Fratter C., Dalgleish R., Allen S.K., Santos R. et al. EMQN best practice guidelines for genetic testing in dystrophinopathies. Eur. J. Hum. Genet. 2020;28(9):1141–59. DOI: 10.1038/ s41431-020-0643-7
7. Aartsma-Rus A., Fokkema I., Verschuuren J., Ginjaar I. et al. Theoretic applicability of antisense-mediated exon skipping for Duchenne muscular dystrophy mutations. Hum. Mutat. 2009;30(3):293–9. DOI: 10.1002/humu.20918
8. Zimowski J.G., Massalska D., Holding M., Jadczak S. et al. MLPA based detection of mutations in the dystrophin gene of 180 Polish families with Duchenne/Becker muscular dystrophy. Neurol. Neurochir. Pol. 2014;48(6):416–22. DOI: 10.1016/j.pjnns.2014.10.004
9. Ervasti J.M., Ohlendieck K., Kahl S.D., Gaver M.G. et al. Deficiency of a glycoprotein component of the dystrophin complex in dystrophic muscle. Nature. 1990;345(6273):315–9. DOI: 10.1038/345315a0
10. Duan D., Goemans N., Takeda S., Mercuri E. et al. Duchenne muscular dystrophy. Nat. Rev. Dis. Primers. 2021;7(1):13. DOI: 10.1038/s41572-021-00248-3
11. Анисимова И.В., Артемьева С.Б., Белоусова Е.Д., Вашакмадзе Н.Д. и др. Мышечная дистрофия Дюшенна: современные подходы к ведению и лечению пациентов. Педиатрическая фармакология. 2023;20(5):427–53. Anisimova I.V., Artemyeva S.B., Belousova E.D., Vashakmadze N.D. et al. Duchenne muscular dystrophy: modern approaches in patient management. Pediatric Pharmacology. 2023;20(5):427–53. (in Russian). DOI: 10.15690/pf.v20i5.2615
12. D'Ambrosio E.S., Mendell J.R. Evolving therapeutic options for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Neurotherapeutics. 2023;20(6):1669–81. DOI: 10.1007/s13311-023-01423-y
13. Hille F., Charpentier E. CRISPR-Cas: biology, mechanisms and relevance. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 2016;371(1707):20150496. DOI: 10.1098/rstb.2015.0496
14. Shmakov S., Abudayyeh O.O., Makarova K.S., Wolf Y. et al. Discovery and functional characterization of diverse class 2 CRISPR-Cas systems. Mol. Cell. 2015;60(3):385–97. DOI: 10.1016/j.molcel.2015.10.008
15. Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K. et al. CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III. Nature. 2011;471(7340):602–7. DOI: 10.1038/nature09886
16. Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M. et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 2012;337(6096):816–21. DOI: 10.1126/science.1225829
17.  Немудрый А.А., Валетдинова К.Р., Медведев С.П., Закиян С.М. Системы редактирования геномов TALEN и CRISPR/CAS — инструменты открытий. Acta Naturae. 2014;6(3):19–40. Nemudryi A.A., Valetdinova K.R., Medvedev S.P., Zakian S.M. TALEN and CRISPR/Cas genome editing systems: tools of discovery. Acta Naturae. 2014;6(3):19–40. (in Russian). DOI: 10.32607/20758251-2014-6-3-19-40
18. Dong C., Gou Y., Lian J. gRNA engineering for improved genome editing and expanded functional assays. Curr. Opin. Biotechnol. 2022;75:102697. DOI: 10.1016/j.copbio.2022.102697
19. Happi Mbakam C., Lamothe G., Tremblay G., Tremblay J.P. CRISPR-Cas9 Gene therapy for Duchenne muscular dystrophy. Neurotherapeutics. 2022;19(3):931–41. DOI: 10.1007/s13311-022-01197-9
20. Xiang X., Zhao X., Pan X., Dong Z. et al. Efficient correction of Duchenne muscular dystrophy mutations by SpCas9 and dual gRNAs. Mol. Ther. Nucleic Acids. 2021;24:403–15. DOI: 10.1016/j.omtn.2021.03.00
21. Min Y.L., Li H., Rodriguez-Caycedo C., Mireault A.A. et al. CRISPR-Cas9 corrects Duchenne muscular dystrophy exon 44 deletion mutations in mice and human cells. Sci. Adv. 2019;5(3):eaav4324. DOI: 10.1126/sciadv.aav4324
22. Koo T., Lu-Nguyen N.B., Malerba A., Kim E. et al. Functional rescue of dystrophin deficiency in mice caused by frameshift mutations using Campylobacter jejuni Cas9. Mol. Ther. 2018;26(6):1529–38. DOI: 10.1016/j.ymthe.2018.03.018
23. Duchene B.L., Cherif K., Iyombe-Engembe J.P., Guyon A. et al. CRISPR-induced deletion with SaCas9 restores dystrophin expression in dystrophic models in vitro and in vivo. Mol. Ther. 2018;26(11):2604–16. DOI: 10.1016/j.ymthe.2018.08.010
24. Xu L., Zhang C., Li H., Wang P. et al. Efficient precise in vivo base editing in adult dystrophic mice. Nat. Commun. 2021;12(1):3719. DOI: 10.1038/s41467-021-23996-y
25. Nishimasu H., Shi X., Ishiguro S., Gao L. et al. Engineered CRISPR-Cas9 nuclease with expanded targeting space. Science. 2018;361(6408):1259–62. DOI: 10.1126/science.aas9129
26. Chemello F., Chai A.C., Li H., Rodriguez-Caycedo C. et al. Precise correction of Duchenne muscular dystrophy exon deletion mutations by base and prime editing. Sci. Adv. 2021;7(18):eabg4910. DOI: 10.1126/sciadv.abg4910
27. Anzalone A.V., Randolph P.B., Davis J.R., Sousa A.A. et al. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature. 2019;576(7785):149–57. DOI: 10.1038/s41586-019-1711-4
28. Happi Mbakam C., Rousseau J., Tremblay G., Yameogo P. et al. Prime editing permits the introduction of specific mutations in the gene responsible for Duchenne muscular dystrophy. Int. J. Mol. Sci. 2022;23(11):6160. DOI: 10.3390/ijms23116160
29. Li H.L., Fujimoto N., Sasakawa N., Shirai S. et al. Precise correction of the dystrophin gene in Duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9. Stem Cell Reports. 2015;4(1):143–54. DOI: 10.1016/j.stemcr.2014.10.013
30. Bulfield G., Siller W.G., Wight P.A., Moore K.J. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1984;81(4):1189–92. DOI: 10.1073/pnas.81.4.1189
31. Sicinski P., Geng Y., Ryder-Cook A.S., Barnard E.A. et al. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 1989;244(4912):1578–80. DOI: 10.1126/science.2662404
32. Chamberlain J.S., Metzger J., Reyes M., Townsend D. et al. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. FASEB J. 2007;21(9):2195–204. DOI: 10.1096/fj.06-7353com
33. Li W., Liu W., Zhong J., Yu X. Early manifestation of alteration in cardiac function in dystrophin deficient mdx mouse using 3D CMR tagging. J. Cardiovasc. Magn. Reson. 2009;11(1):40. DOI: 10.1186/1532-429X-11-40
34. Wells D.J., Wells K.E. Gene transfer studies in animals: what do they really tell us about the prospects for gene therapy in DMD? Neuromuscul. Disord. 2002;12(Suppl.1):S11–22. DOI: 10.1016/s0960-8966(02)00077-9
35. Araki E., Nakamura K., Nakao K., Kameya S. et al. Targeted disruption of exon 52 in the mouse dystrophin gene induced muscle degeneration similar to that observed in Duchenne muscular dystrophy. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997;238(2):492–7. DOI: 10.1006/bbrc.1997.7328
36. Morrison J., Lu Q.L., Pastoret C., Partridge T. et al. T-cell-dependent fibrosis in the mdx dystrophic mouse. Lab. Investigati. 2000;80(6):881–91. DOI: 10.1038/labinvest.3780092
37. Farini A., Meregalli M., Belicchi M., Battistelli M. et al. T and B lymphocyte depletion has a marked effect on the fibrosis of dystrophic skeletal muscles in the scid/mdx mouse. J. Pathol. 2007;213(2):229–38. DOI: 10.1002/path.2213
38. Young C.S., Mokhonova E., Quinonez M., Pyle A.D. et al. Creation of a novel humanized dystrophic mouse model of Duchenne muscular dystrophy and application of a CRISPR/Cas9 gene editing therapy. J. Neuromuscul. Dis. 2017;4(2):139–45. DOI: 10.3233/JND-170218
39. Cooper B.J., Winand N.J., Stedman H., Valentine B.A. et al. The homologue of the Duchenne locus is defective in X-linked muscular dystrophy of dogs. Nature. 1988;334(6178):154–6. DOI: 10.1038/334154a0
40. Sharp N.J., Kornegay J.N., Van Camp S.D., Herbstreith M.H. et al. An error in dystrophin mRNA processing in golden retriever muscular dystrophy, an animal homologue of Duchenne muscular dystrophy. Genomics. 1992;13(1):115–21. DOI: 10.1016/0888-7543(92)90210-j
41. Amoasii L., Hildyard J.C.W., Li H., Sanchez-Ortiz E. et al. Gene editing restores dystrophin expression in a canine model of Duchenne muscular dystrophy. Science. 2018;362 (6410):86–91. DOI: 10.1126/science.aau1549
42. Howell J.M., Fletcher S., Kakulas B.A., O'Hara M. et al. Use of the dog model for Duchenne muscular dystrophy in gene therapy trial. Neuromuscul. Disord. 1997;7(5):325–8. DOI: 10.1016/s0960-8966(97)00057-6
43. Klymiuk N., Blutke A., Graf A., Krause S. et al. Dystrophin-deficient pigs provide new insights into the hierarchy of physiological derangements of dystrophic muscle. Hum. Mol. Genet. 2013;22(21):4368–82. DOI: 10.1093/hmg/ddt287
44. Yu H.H., Zhao H., Qing Y.B., Pan W.R. et al. Porcine zygote injection with Cas9/sgRNA results in DMD-modified pig with muscle dystrophy. Int. J. Mol. Sci. 2016;17(10):1668. DOI: 10.3390/ijms17101668
45. Goemans N., Tulinius M., van den Akker J.T., Burm B.E. et al. Systemic administration of PRO051 in Duchenne's muscular dystrophy. N. Engl. J. Med. 2011;364(16):1513–22. DOI:10.1056/NEJMoa1011367
46. Wu Z., Yang H., Colosi P. Effect of genome size on AAV vector packaging. Mol. Ther. 2010;18(1):80–6. DOI: 10.1038/mt.2009.255
47. Lin Y., Luo X., Burghardt T., Dorrer S. et al. Chemical evolution of amphiphilic xenopeptides for potentiated Cas9 ribonucleoprotein delivery. J. Am. Chem. Soc. 2023;145(28):15171–9. DOI: 10.1021/jacs.3c01902
48. Kleinstiver B.P., Pattanayak V., Prew M.S., Tsai S.Q. et al. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature. 2016;529(7587):490–5. DOI: 10.1038/nature16526
49. Crudele J.M., Chamberlain J.S. Cas9 immunity creates challenges for CRISPR gene editing therapies. Nat. Commun. 2018;9(1):3497. DOI: 10.1038/s41467-018-05843-9
50. Tabebordbar M., Zhu K., Cheng J.K.W., Chew W.L. et al. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells. Science. 2016;351(6271):407–11. DOI: 10.1126/science.aad5177